一氧化氮合酶染色法的具体操作步骤

    一氧化氮合酶（nitrfic oxides synthase，NGS）是一种连接酶，能催化前体物质L精氨酸L瓜氨酸和一氧化氮（NO）。NO是中枢和外周神经系统中的一种神经递质，活细胞间信使和内皮源性松弛血管的介质，在神经、心血管及免疫系统中有广泛的作用。NO极不稳定。易于扩散游离，半衰期短，不易检测。因NOS是合成NO的关键酶，故通常通过检测NOS的活性来评估NO的分布和功能。NOS有3种异构型，即神经型NOS（neuronal NOS，nNOS）、内皮型NOS（endothelial NOS。eNOS）和细胞因子诱导型NOS（inducible NOS，iNOS）。由于还原型辅酶Ⅱ—黄递酶（NADPH-d）与NOS在化学结构和组织定位上有*的一致性，且也与NO密切相关．故人们常采用NADPH-黄递酶法来显示NOS活性。
 
    1．原理  在βNADPH存在下，NOS的C末端能将NADPH电子转移到NBT，将NBT还原成不溶性蓝紫色甲腊沉淀产物。
 
    2．孵育液配制
    β—NADPH                   10mg
    NBT                        5mg
    Triton X—100              0．03ml
    0．05mol/L TB（pH 8．0）     9．97ml
    临用前配制。
 
    3．染色程序
    （1）固定：4％多聚甲醛（0．1mol/LPBS配制）灌流固定，取材后入同样固定液再固定1小时（4℃），20％蔗糖中4℃过一夜；
    （2）冰冻切片：厚10—401．Lm；
    （3）孵育：切片人孵育液中37％孵育30分钟～1小时；
    （4）终止反应：切片人0．05mol/LTB或蒸馏水中；分钟；
    （5）常规脱水、透明、封片或直接用甘油明胶封片。
 
    4．结果与评价  反应产物为蓝色或蓝紫色沉淀。NADPH-黄递酶法显示NOS活性，方法简便经济，应用广泛，但不能区分NOS亚型。
 
    5．对照实验  在孵育液中除去β—NADPH或用0．1mol/L N—亚硝基精氨酸（NOS抑制剂）预孵育切片1小时，结果应为阴性。

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