一、明确检测目标?

1.检测对象是什么？

明确待测物是细胞因子、激素、病毒抗体还是其他蛋白。不同试剂盒针对的抗原表位和抗体对可能不同。

关键点：查看试剂盒说明书中的“检测范围"和“交叉反应"，确认是否覆盖你的目标物种和异构体（如人/小鼠/大鼠）。

2.需要定量还是定性？

定量试剂盒需提供标准品和标准曲线，适合精确测量浓度；定性试剂盒（如诊断用）通常只判断阴阳性。

二、匹配样本类型

不同样本的处理方式可能影响检测结果：

血清/血浆：需避免溶血、脂血（可能引起非特异性结合）。

细胞培养上清：注意培养基中是否含高浓度BSA或胎牛血清（可能干扰检测）。

组织裂解液：需验证裂解缓冲液成分是否与试剂盒兼容（如避免强去垢剂）。

提示：试剂盒说明书会标注已验证的样本类型，若使用特殊样本（如脑脊液、唾液），建议先做预实验验证。

三、选择试剂盒类型

ELISA有四大常见类型，适用场景不同：

优先选择夹心法（灵敏度高、特异性强），但小分子只能选竞争法。

四、评估试剂盒性能

1.灵敏度与检测限

灵敏度（最-低检测浓度）和检测范围需覆盖你的样本浓度。例如：检测血清细胞因子时，若样本浓度低，需选择高灵敏度试剂盒（如灵敏度≤1 pg/mL）。

2.批间差与稳定性

查看厂商是否提供不同批次的CV（变异系数）数据，批间差应<15%。避免因批次差异导致实验重复性差。

3.抗体对来源

单克隆抗体特异性高但可能识别单一表位；多克隆抗体灵敏度高但需验证交叉反应。建议选择经Western Blot或质谱验证的抗体。

五、验证与优化

阳性/阴性对照：试剂盒应提供明确对照，用于判断实验有效性。

回收率实验：在样本中加入已知浓度标准品，回收率应在80%-120%。

重复性测试：同一样本重复3次检测，CV值应<10%。

若背景信号过高，可尝试：缩短显色时间、优化封闭液（如使用5%脱脂奶粉）、增加洗涤次数。