一、ELISA基本原理

ELISA通过抗原-抗体的特异性结合，利用酶催化底物显色反应进行定量或定性分析。常见的类型包括直接法、夹心法和竞争法，但其核心步骤均依赖于以下三类关键试剂。

二、核心试剂一：包被抗体/抗原——实验的“基石"

作用：作为固相载体（微孔板）的固定化分子，捕获目标物。

纯度与活性：高纯度避免交叉反应，确保结合效率（建议使用单克隆抗体）。

包被浓度优化：预实验确定最佳浓度（通常1-10 μg/mL），浓度过高易导致空间位阻。

缓冲液选择：碳酸盐缓冲液（pH 9.6）常用，避免含BSA或Tween的溶液。

常见问题：

非特异性结合：增加封闭步骤（如5%脱脂牛奶或BSA封闭1小时）。

包被不均：4℃过夜包被优于室温2小时，提高结合稳定性。

三、核心试剂二：酶标抗体——信号的“放大器"

作用：与目标物结合后催化底物显色，将生物学信号转化为光学信号。

酶的种类：

HRP（辣根过氧化物酶）：常用，底物为TMB（显蓝色）或OPD（显黄色），灵敏度高。

AP（碱性磷酸酶）：底物为pNPP（显黄色），适用于磷酸盐缓冲体系。

标记效价：高效价减少用量，降低成本（建议效价≥1:5000）。

保存条件：HRP需避光保存，避免反复冻融（分装后-20℃储存）。

注意事项：

避免与叠氮钠（HRP抑制剂）共用，可选择ProClin 300作为防腐剂。

四、核心试剂三：底物显色系统——结果的“可视化"

作用：酶催化底物生成有色产物，通过吸光度值定量目标物浓度。

常用底物对比：

优化技巧：

显色时间控制：室温避光反应10-30分钟，避免过度显色导致背景升高。

终止时机：当标准品最高浓度孔显色明显时立即终止。

五、实验流程关键步骤

包被：100μL/孔，4℃过夜。

封闭：含1% BSA的PBS，37℃1小时。

加样：样本梯度稀释，37℃孵育1小时。

酶标抗体孵育：37℃1小时，洗涤3次（0.05% Tween-20 PBS）。

显色与终止：TMB显色15分钟，2M H?SO?终止。

读数：双波长检测（450 nm/630 nm校正孔间误差）。

六、常见问题与解决方案‌

高背景噪音‌：增加洗涤次数（5次以上），检查封闭液是否失效。

低信号值‌：优化包被浓度或延长底物孵育时间。

孔间差异大‌：使用多通道移液器，确保加样一致性。