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ELISA实验的技术要点(二)
更新时间:2019-07-30      阅读:1159

你是否在为做实验的时候没有掌握到要点而担心?没关系上海恒远生物科技有限公司来告诉你。ELISA 的技术要点包括三个方面:试剂的制备、反应条件的选择和操作的标准化。

    一、反应条件的选择、适工作浓度的选择

    在建立某一 ELISA 测定中,应对包被抗原或抗体的浓度和酶标抗原或抗体的浓度予以选择,以达到合适的测定条件和节省测定费用。下面以间接法测抗体和夹心法测抗原为例,介绍适工作浓度的选择方法。

    (一)间接法测抗体

    1.酶标抗抗体工作浓度的选择

    (1)用100ng/ml人IgG进行包被,洗涤。

    (2)将酶标抗人IgG用稀释液作一系列稀释后分别加入已包被的孔中,保温,洗涤。

    (3)加底物显色。加酸终止反应后,读取吸光度(A),绘制曲线如图15-10。读取A值在 1.0 时的酶标抗体稀释度,作为酶标抗体的工作浓度。该酶标抗人 IgG 的工作浓度应为1/1600。

    2.棋盘滴定法选择包被抗原工作浓度

    (1)用包被液将抗原作一系列稀释后进行包被,洗涤。

    (2)将强阳性参考血清、弱阳性参考血清和阴性参考血清用稀释液作1:100稀释,加样,保温,洗涤。

    (3)加按工作浓度稀释的酶标抗人IgG抗体,保温,洗涤。

    (4)加底物显色。加酸终止反应后读取A值。

    (5)选择强阳性参考血清的A值为0.8左右、阴性参考血清的A值小于0.1的包被抗的的稀释度作为工作浓度。表15-1为本例的测定结果,表中数字为A值。从表中可见1:200为zui舒适的工作浓度。

    各类血清 抗原稀释度

    1:50 1:100 1:200 1:400 1:800

    强阳性 1.20 1.04 0.84 0.68 0.42

    弱阳性 0.64 0.41 0.30 0.22 0.19

    阴性 0.23 0.13 0.08 0.66 0.05

    稀释液 0.09 0.02 0.02 0.02 0.04

    (二)夹心法测抗原

    在夹心法 ELISA 法中可用棋盘滴定法同时选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度,举例如下:

    夹心 ELISA 包被抗体和酶标抗体工作浓度的选择

    包被抗体的浓度及 参考抗原

    酶标抗体稀释度 强阳性(25ng/ml)弱阳性(1.5ng/ml)阴性

    10 μg/ml

    1:1000 1.17 0.15 0.09

    1:5000 0.46 0.03 0

    1:25000 0.12 0 0

    1 μg/ml

    1:1000 >2 0. 25 0.10

    1:5000 0.91 0.12 0.01

    1:25000 0.25 0.01 0

    0.1 μg/ml

    1:1000 0.42 0.13 0.13

    1:5000 0.11 0.03 0.02

    1:25000 0.03 0 0

    (1)抗体免疫球蛋白用包被缓冲液稀释至蛋白浓度为 10、1 和 0.1 μg/ml,分别在 ELISA 板上进行包被,每一浓度包括三个纵行,洗涤。

    (2)在一个横行各包被孔中加入强阳性抗原液,另一横行加入弱阳性抗原液,第三横行加入阴性对照液,保温,洗涤。

    (3)将酶标抗体用稀释液稀释成三个浓度,例如 1:1000、1:5000 和 1:25000。分别加入每一包被浓度的一个纵行中,保温,洗涤。

    (4)加底物显色。加酸终止反应后,读取 A 值。

    (5)以强阳性抗原的 A 值在 0.8 左右、阴性参考的 A 值小于 0.1 的条件作适条件,据此选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度。从表 15-2 可看出包被抗体浓度可选用 1 μg/ml,酶标抗体的稀释度可选为 1:5000。为了进一步节省试剂,可以此浓度为基点,缩小间距再做进一步的棋盘滴定。

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